الفهرس 
Bacillus species and their UsesOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 181 |  |  |
| | | from | 181 | | |
Abstract
الهدف من التجربة:
تهدف الدراسة الحالية إلى إنتاج بعض إنزيمات البروتييز من بكتريا باسيلس ثيورينجنسس المنتجة للمبيدات الحيوية للحشرات، مع دراسة فسيولوجيا إنتاج والخواص الكيموحيوية لإنزيمات البروتييز المنتجة من هذه البكتريا متضمنة التقدير الكمى للنشاط الإنزيمى والعوامل الفسيولوجية المؤثرة على انتاجه ، تنقية الإنزيم ودراسة خواصه الكيموحيوية للإنزيم الخام والمنقى ، وإمكانية إنتاجه باستخدام البيئات الناتجة من مخلفات المصانع والزراعة، بالاضافة لبعض تطبيقات الإنزيم الخام.
الهدف الآخر تقييم إمكانية إنتاج الكيتينيز على بيئة تخمر صلبة ومغمورة بواسطة الباسيلس ثيورينجنسس ديندروليمس.
الطرق والنتائج:
1- السلالات البكتيرية: تم اختيار باسيلس ثيورينجنسس ديندروليمس.
2- التخمرات الصلبة وتهيئة ظروفها: أعلى مستويات النشاط الانزيمى تم الحصول عليها باستخدام بيئة ردة القمح كبيئة نمو كاملة، الفركتوز والمانيتول كمصدر كربونى، حجم اللقاح 38%، محتوى رطوبى 67%، أقل حجم حبيبات ردة (أقل من 1 مم) كان أعلى نشاط إنزيمى وأفضل مدة نمو بعد 3 أيام.
3- استخلاص البروتييزمن البيئة المتخمرة: ماء الصنبور كان مناسب بكفاءة لاستخلاص الانزيم.
4- الخواص الكيموحيوية للانزيم الخام: 0,181 مجم بروتين/ مل، 5 ق، 60 درجة مئوية ودرجة حموضة 9 كانت افضل نشاط انزيمى.
5- أ- تنقية البروتييز القلوى باستخدام الترسيب بسلفات الامونيوم: عند 60 – 75% تشبع.
ب- تنقية البروتييز القلوى باستخدام الترسيب بالاسيتون: عند 30 – 45 % تركيز الاسيتون.
ج- تنقية البروتييز القلوى باستخدام عمود الكروماتوجرافى سيفاديكس: معامل التنقية يصل الى 5,36 مرة ومعامل استخلاص 1,9 % من الانزيم الخام.
6- بعض تطبيقات البروتييز القلوى: أ- منظفات الغسيل: وجد ان البرسيل كان اكثر توافقا مع الانزيم البروتييز القلوى عن التايد والاريال.
ب- تحليل الجيلاتين وتحرر الفضة من أفلام أشعة اكس المستعملة: يستطيع البروتييز القلوى تحرير الفضة خلال 1 س.
7- تقدير ن استيل جلوكوز أمين بواسطة التحليل الكروماتوجرافى عالى الآداء: التخمرات الصلبة تنتج كيتينيز أعلى من التخمرات المغمورة.
أجريت دراسات فسيولوجية على إنتاج أنزيم البروتييز القلوى من عدة أنواع وسلالات من بكتيريا الباسيلس ثيورينجنسس المنماه على عدة أنواع من البيئات الميكروبية تحت ظروف تنمية مختلفة. حيث تمت دراسة تأثير كل من النوع والسلالة الميكروبية (ثلاثون سلالة Bacillus thuringiensis) ونوع بيئات التنمية الميكروبية المكملة supplementary media المستخدمة فى بيئات النمو والمكونة من NYSM (المرق المغذى لمستخلص الخميرة) أو فول الصويا soybean على إنتاج أنزيم البروتييز القلوى ، تحت ظروف المزرعة المغمورة (المهتزة) SmF. وأيضا تمت دراسة إنتاج الأنزيم من أكثر المزارع إنتاجاً للبروتييز القلوى (تسعة) تحت ظروف التنمية على المنابت الصلبة SSF، ردة القمح wheat bran (الظروف القياسية). وكذلك تمت دراسة إنتاج أنزيم البروتييز القلوى من أكثر المزارع إنتاجاً (أربعة) فى وجود أو عدم وجود فول الصويا كمكمل لبيئة ردة القمح، تحت الظروف القياسية.
وقد أجريت أيضا دراسات فسيولوجية أخرى تفصيلية على إنتاج البروتييز القلوى من السلالة المختارة (Bacillus thuringiensis dendrolimus 4A/4B) تحت ظروف المزرعة الصلبة SSF (الظروف القياسية). حيث تمت دراسة تأثير التنمية على عدة مخلفات زراعية كبيئات نمو أساسية Substrates (Growth Media) (كمصادر كربونية ونيتروجينية) على إنتاج البروتييز القلوى من أكثر السلالات إنتاجاً للأنزيم (Bacillus thuringiensis dendrolimus 4A/4B)، تحت ظروف المزرعة الصلبة SSF. وقد كان المصدر الرخيص ردة القمح أفضل المصادر الطبيعية. وبدراسة تأثير إضافة مصادر كربونية أخرى مكملة للمصدر الأساسى للبيئة substrate (ردة القمح) على إنتاج الأنزيم من باسيلس ثيورينجنسس دندروليمس، تحت ظروف المزرعة الصلبة SSF (الظروف القياسية) وقد أدت كل المصادر المكملة إلى تنشيط إنتاج الأنزيم تحت الدراسة بنسب تراوحت بين 35 و 223%، ماعدا النشا الذائب الذى سبب إنخفاضا طفيفا، وقد كان أفضلها المانيتول والفركتوز الذين أعطيا أعلى زيادة فى إنتاج الأنزيم (220 و 223% ، على التوالى). وبدراسة تأثير حجم اللقاح على إنتاج الأنزيم من الميكروب المنمى على البيئة الصلبة SSF(ردة القمح). وقد وجد ان أفضلها 38% (حجم/وزن). وبدراسة تأثير نسبة الرطوبة الأولية فى البيئة على إنتاج الأنزيم من الميكروب المنمى على بيئة ردة القمح كان أفضلها نسبة رطوبة 67% (حجم/وزن). وبدراسة تأثير حجم حبيبات المصدر الأساسى للبيئة substrate (ردة القمح) على إنتاج الأنزيم كان حجم الحبيبات الأقل من 1 مم هو الأفضل. وبدراسة تأثير مدة تحضين المزرعة على إنتاج الأنزيم كانت أفضل مدة تحضين 3 أيام ، عند درجة حرارة 30 درجة مئوية. وبدراسة تأثير نوع محلول الإستخلاص المستخدم لإستخلاص الأنزيم من البيئة الميكروبية على نشاط الأنزيم كان ماء الصنبور هو الأفضل.
أجريت أيضا دراسة الخواص الكيميائية الحيوية للأنزيم الخام. وبدراسة أفضل الظروف لنشاط الأنزيم فى محلول التفاعل الأنزيمى وجد أن أفضل تركيز للأنزيم هو 0.181 مجم بروتين/مل. وأفضل درجة حرارة 60 درجة مئوية وأفضل درجة حموضة 9.
تم إجراء دراسات على التنقية الجزئية للأنزيم الخام. وقد وجد أعلى نشاط للأنزيم عند 60-75% كبريتات الأمونيوم ثم عند 30-45% أسيتون. ثم تم إستكمال عمليات التنقية بعمود سيفادكس 100.
وأيضا أجريت دراسة الخواص الكيميائية الحيوية للانزيم المنقى. وقد أظهر الأنزيم ثباتا بدرجات متفاوتة فى وجود كل التركيزات المستخدمة من فوق أكسيد الهيدروجين و PMSF. بينما ثبط تماما فى وجود 10 ملليمولر EDTA ونشط فى وجود نفس التركيز من المركابتوإيثانول. وبناء عليه فإن الأنزيم محل الدراسة يتبع أنزيمات الميتالوبروتييز. وقد وجد أيضا أن كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 مليمولر قد نشطت الأنزيم. وكان أفضل درجة حموضة عند 8 و 10. وأفضل درجة حرارة 50 درجة مئوية. وأفضل تركيز للأنزيم النقى فى محلول التفاعل هو 0.014 مجم بروتين/مل. وقد وجد أن ثابت ميكائيل 0,833% {(وزن/حجم)، بإستخدام الكازين كمادة تفاعل}.
تم إستخدام أنزيم البروتييز المنتج فى الدراسة الحالية بنجاح فى مجال المنظفات خاصة فى وجود البرسيل والتايد وبدرجة أقل فى وجود الإيريال. وكذلك تم إستخدام الأنزيم بنجاح فى مجال إستخلاص الفضة من أفلام آشعة X المستعملة بعد تحليل الجيلاتين بها تماما فى خلال ساعة.
أجريت أيضا دراسة إنتاج أنزيم الكيتينيز من السلالة المختارة (Bacillus thuringiensis dendrolimus 4A/4B) وقد وجد أن وجود الكيتين أعاق النمو الميكروبى طوال يومين كاملين ولم يظهر أى نمو بكتيرى ولا إنتاج للأنزيم خلال اليومين ثم بدأ ظهور نشاط الأنزيم فى اليوم الثالث بالغا أقصاه فى اليوم السادس، بينما ثبت النمو الميكروبى مبكرا منذ اليوم الرابع. وباستخدام جهاز HPLC لتقدير الNAG (ن، أستيل جلوكوز أمين) المنفرد نتيجة التحلل الانزيمى للكيتين بواسطة انزيم الكيتينيز محل الدراسة. وجد أن إنتاج الإنزيم تحت ظروف كل من المزرعة الصلبة و المغمورة SmF and SSF وجد أن إنتاجه فى المزرعة الصلبة SSF أعلى منه فى حالة المغمورة SmF(2.05 و 0.693 وحدة [ميكرومول/ مل/ دقيقة]، على التوالى).