الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 282 |  |  |
| | | from | 282 | | |
Abstract
على مدى العقدين الماضيين تطور مرض تدهن الكبد غير الكحولى أو الكبد الدهنى من مرض غير معروف الى السبب الأكثر شيوعًا لمرض الكبد المزمن في جميع أنحاء العالم حيث تصل نسبة انتشاره حديثا الى (25-24%)، فهو من أهم وأخطر الأمراض المنتشرة التى تصيب الإنسان بنسبة ملحوظة فى العصر الحديث. و يعتبر هذا المرض حالة لم يوجد طريق فعال لمنع حدوثها او دواء فعال للشفاء منها نهائبا حتى الان بالرغم من المحاولات الحثيثه والكثيره. ينتج هذا المرض بسبب الخلل فى التمثيل الغذائى للدهون الناتج عن السمنه المفرطة التى تعد السبب الرئيسى لهذا المرض بالاضافه الى بعض المسببات الجينيه اوالمرتبطه بالبيئه.
ويؤدى الدهن الكبدى أحياناً الى إلتهابات تدريجىة من التنكس الدهنى ((Steatosis الى إلتهاب الكبد الدهنى (Steatohepatitis)، وتطور هذا المرض يعتمد على دوام أو قوة المسبب الرئيسى له. وغالباً ما يتطور الكبد الدهنى إلى حالات متقدمة من المرض إذا لم يتم علاجه الى إلتهابات شديدة ومزمنه ونسبة عالية من التدهن حيث يؤدى أخيرا الى النخر الكبدى (موت الخلايا)، وحيث غالبا ماتؤدى هذه الإلتهابات الشديده، أو موت خلايا الكبد إلى التليف الكبدى الذى قد ينتشر على نطاق واسع، و يتطور أخيرا إلى مرض تشمع الكبد، ولكن بنسب قليله، المعروف جيداً فى حالات التدهن الكبدي الكحولى.
لذلك بدأ الباحثون فى العصر الحديث فى استهداف السمنه كعلاج لمرض التدهن الكبدى اللاكحولى، كما انه يمكن ايضا استهداف التدهن الكبدى اللاكحولى فى علاج السمنه، وتعد ممارسة الحياه الصحية العلاج الاول والفعال فى منع حدوث او تقليل أعراض هذا المرض حتى الان.
كما يعكف الباحثون فى العصر الحديث على استخدام المواد الطبيعية ذات المنشأ النباتى كمواد وقائية وعلاجية، لتقليل مخاطر حدوث التدهن الكبدى اللاكحولى، أوعلاجه.
من هنا جاءت فكرة هذه الرسالة ، لمعرفة مدى كفاءة بعض المواد الطبيعية، لما تتميز به كمخفضات للدهون أو مضادات أكسدة أو مضادات إلتهابات ، فى علاج الإلتهاب الكبدى الدهنى.
فى هذه الرسالة تم استخدام مادة البروانثوسياندين، المستخلصة من بذور العنب، والذى يتم التركيز عليها فى الفترة الاخيره لدراسة تأثيرها العلاجى لكثير من الأمراض بما فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى، كمادة مضادة للاكسدة وعلاج منفرد أو كعلاج ثنائى مع كلا من عقار مضاد التخثر(كلوبيدوجريل)(Clopidogrel/Plavix®) أو مع عقار خالب الحديد الزائد (ديفيروكسامين)(Defroxamine/Desfral®)، وذلك كمحاولة لعلاج هذا المرض المحدث فى كبد الفئران تجريبياً عن طريق تناول عليقة عالية الدهون لمدة 6 اسابيع.
وقد أجريت هذه الدراسة على عدد 40 من ذكور الفئران البيضاء وتتراوح أعمارها بين ستة إلى ثمانية أسابيع وأوزانها بين 160- 200 جرام، تم احضار هذه الفئران من مركز بحوث حيوانات التجارب بكلية الطب البيطرى/جامعة بنها. وقد تم ايواء هذه الفئران فى أقفاص معدنية منفصلة وزودت بالمياه العذبة النقية وابقيت الفئران على ظروف بيئية وغذائية ثابتة طوال أربعة عشر يوما للتأقلم قبل بداية التجربة. وقد تم تقسيم الفئران إلي خمسة مجموعات كلا منها إشتملت على 8 فئران على النحو التالى:
المجموعة الأولي:(المجموعة الضابطة الطبيعية): إشتملت على 8 جرذان تم تغذيتها على العليقة الطبيعية ولم تعطى طوال فترة التجربة.
المجموعة الثانية:(المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى): إشتملت على 8 جرذان تم تغذيتها على غذاء عالي الدهون لمدة ستة اسابيع الأولى من التجربة لإحداث مرض الكبد الدهنى اللاكحولى، ثم استمرت التغذيه بعد ذلك على العليقة الطبيعية ولم تعطى أي أدوية لمدة 6 اسابيع اخرى.
المجموعة الثالثة: (المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى والمعالجة بمادة البروانثوسياندين): إشتملت على 8 جرذان محدث فيها مرض الكبد الدهني اللاكحولي وقد تم تجريعها مادة البروانثوسياندين عن طريق الفم بجرعة مقدارها 200 ميللى جرام/كيلو جرام من وزن الجسم لمده 6 اسابيع أخرى.
المجموعة الرابعة:(المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى والمعالجة بمادة البروانثوسياندين + عقار كلوبيدوجريل): إشتملت على 8 جرذان وقد تجريعها بكلا من مادة البروانثوسياندين (200 ميللى جرام/كيلو جرام) وعقار مضاد التخثر (كلوبيدوجريل) (6.5 ميللى جرام/كيلو جرام) من وزن الجسم عن طريق الفم لمده 6 اسابيع أخرى.
المجموعة الخامسة:(المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى والمعالجة بمادة البروانثوسياندين + عقار ديفيروكسامين): إشتملت على 8 جرذان حيث تم تجريعها بكلا من مادة البروسياندين200 ميللى جرام/كيلو جرام من وزن الجسم عن طريق الفم لمده 6 اسابيع أخرى وحقنها بعقار خالب الحديد (ديفيروكسامين) في التجويف البروتونى بجرعة مقدارها 100 ميللى جرام/كيلو جرام من وزن الجسم لمده 15 يوم فقط من بداية العلاج وإحداث المرض.
تم ذبح الفئران والحصول على عينات الدم والأنسجة مرة واحدة بعد نهاية التجربة عند الأسبوع 12 أي بعد 6 أسابيع من بداية العلاج وإحداث المرض.
العينات:
تم تجميع عينات الدم بعد الصيام لمدة 12 ساعة وعينات الأنسجة الكبدية من جميع مجاميع الفئران (الضابطة والمصابة) مرة واحدة فى نهاية التجربة.
عينات الدم:
تم جمع عينات الدم من الجيب الوريدي خلف العين في أنابيب نظيفة، جافة ومعقمة وترك العينة 15 دقيقة حتى تتجلط ثم فصل المصل بواسطة جهاز الطرد المركزي وذلك عند سرعة 3000 لفة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة بعدها تم جمع المصل في أنابيب جافة ومعقمة بواسطة ماصة أتوماتيكية.
استخدم المصل مباشرة فى إجراء القياسات البيوكيميائية الآتية: نشاط انزيمات الكبد (ألانين أمينو ترانسفيريز، اسبارتات أمينو ترانسفيريز وجاما جلوتاميل ترانسفيراز)، مستوى الدهون (الكولسترول الكلى وثلاثى الجلسريدات)، بالاضافة الى تركيز الفيرتين.
تم حفظ باقى المصل في المجمد عند درجة 20˚ مئوية تحت الصفر وذلك لإجراء التحليل الجزيئى لكلا من: ميكرو ار ان ايه-128-3بي وميكرو ار ان ايه-378.
عينات الأنسجة:
تم أخذ جزء أخر من أنسجة الكبد ثم غسيلهم جيداً بمحلول ملح فسيولوجى (0.9%) ووضعها في أنابيب إيبندورف وتم الاحتفاظ بها على الفور في النيتروجين السائل وتخزينها في 80˚ تحت الصفر حتى استخلاص الحمض النووي الريبوزي تم إستخلاص شريط الحمض النووى الرسول mRNA ثم تصنيع الشريط المكمل من الحمض النووى دى أوكسى ريبوز cDNA ثم استخدام تفاعل إنزيم البلمرة المتسلسل لقياس التعبير النسبى الجيني لكل من:
إنترليوكين-1بيتا، مستقبلات البيروكسيسوم المنتشر المنشط- ألفا، عامل النمو المحول-1بيتا، مثبط الأنسجة للبروتينات المعدنية-1، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية- ألفا بالاضافة الى كيناز البروتين المنشط ميتوجين. ومن ناحية أخرى تم قياس مستوى ميثيل الحمض النووي دى أوكسى ريبوز ونشاط هيستون أسيتيل ترانسفيراز.
عينات الهستوباثولوجى:
تم الحصول على عينات الكبد من أجزاء مختلفة من الكبد وتم حفظها فى فورمالين متعادل 10%، ثم تحضير العينات وصبغها بالصبغات الخاصة ووضعها على الشرائح ووضع الغطاء وتثبيته ثم تم فحصها ميكروسكوبياً وتصويرها وتوصيفها عن طريق متخصص فى علم الهيستوباثولوجى.
وقد أظهرت النتائج بعد تحليلها إحصائيا الآتي:
أولا: نتائج التحاليل الكيميائية الحيوية فى المصل:
1. نشاط إنزيمات الكبد (ألانين أمينو ترانسفيريز- اسبارتات أمينو ترانسفيري, جاما جلوتاميل ترانسفيراز):
أظهرت النتائج وجود زيادة معنوية في نشاط الإنزيمات الكبدية الثلاثة في أمصال الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة أو مع عقار مضاد التخثر أو عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى نشاط الانزيمات الكبدية وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
2. تركيز الكولسترول الكلى وثلاثى الجلسريدات:
أسفرت النتائج وجود زيادة معنوية فى مستوى الكولسترول الكلى وثلاثى الجلسريدات في أمصال الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة أو مع عقار مضاد التخثر أو عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى مستوى الكولسترول الكلى وثلاثى الجلسريدات وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
3. تركيز الفيرتين:
أظهرت النتائج وجود زيادة معنوية في مستوى الفيرتين في أمصال الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى ذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة أو مع عقار مضاد التخثر أو عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى مستوى الفيرتين وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
ثانيا: نتائج التحاليل الجزيئ:
1. التحليل الجزيئى لميكرو ار ان ايه-128-3بي وميكرو ار ان ايه-378 في المصل:
أظهرت النتائج وجود زيادة معنوية فى مستوى التعبير النسبى للجينات ميكرو ار ان ايه-128-3بي وميكرو ار ان ايه-378 في أمصال الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة أو مع عقار مضاد التخثر أو عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى مستوى التعبير النسبى للجينات ميكرو ار ان ايه-128-3بي وميكرو ار ان ايه-378 في مصل الفئران وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
2. التعبير النسبى لجينات إنترليوكين-1بيتا، مستقبلات البيروكسيسوم المنتشر المنشط -ألفا، عامل النمو المحول-1بيتا، مثبط الأنسجة للبروتينات المعدنية- 1 في الكبد:
أسفرت النتائج وجود زيادة معنوية فى مستوى التعبير النسبى للجينات لكل من إنترليوكين-1بيتا، مستقبلات البيروكسيسوم المنتشر المنشط -ألفا، عامل النمو المحول-1بيتا، مثبط الأنسجة للبروتينات المعدنية-1 في أنسجة كبد الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة او مع عقار مضاد التجلط أو مع عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى مستويات التعبير النسبى الجينى لكل من إنترليوكين-1 بيتا، مستقبلات البيروكسيسوم المنتشر المنشط -ألفا، عامل النمو المحول-1 بيتا، مثبط الأنسجة للبروتينات المعدنية-1 فى أنسجة كبد الفئران وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة. كما أكدت التغيرات الهستوباثولوجية تلك النتائج.
3. التعبير النسبى لجينات عامل نمو بطانة الأوعية الدموية، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية-ألفا وكيناز البروتين المنشط ميتوجين في الكبد:
أظهرت النتائج وجود زيادة معنوية في مستوى التعبير النسبى للجينات لكل من عامل نمو بطانة الأوعية الدموية، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية-ألفا وكيناز البروتين المنشط ميتوجين في أنسجة كبد الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة او مع عقار مضاد التخثر أو مع عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى مستوى التعبير النسبى الجينى لكل من عامل نمو بطانة الأوعية الدموية، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية-ألفا وكيناز البروتين المنشط ميتوجين فى أنسجة كبد الفئران وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
4.ميثيل الحمض النووي في الكبد:
أسفرت النتائج عن وجود انخفاض معنوى فى مستوى ميثيل الحمض النووي في أنسجة كبد الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة أو مع عقار مضاد التخثر أو عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى زيادة معنوية فى مستوى ميثيل الحمض النووي في أنسجة كبد الفئران وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
5. إجمالي نشاط هيستون أسيتيل ترانسفيراز في الكبد:
أسفرت النتائج وجود زيادة معنوية في إجمالي نشاط هيستون أسيتيل ترانسفيراز في أنسجة كبد الفئران المحدث فيها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى وذلك عند المقارنة بالمجموعة الضابطة الطبيعية. بينما أدت المعالجة بكلا من مادة البروانثوسياندين المستخلصة من بذور العنب منفردة أو مع عقار مضاد التخثر أو عقار خالب الحديد للفئران المريضه إلى انخفاض معنوى فى مستوى إجمالي نشاط هيستون أسيتيل ترانسفيراز في أنسجة كبد الفئران وذلك عند مقارنتها بمجموعة الفئران المريضة.
ثالثا: الفحص الهستوباثولوجى لأنسجة الكبد:
1. المجموعة الأولي:(المجموعة الضابطة الطبيعية): أظهر الفحص الهيستوباثولوجى المجهرى لكبد الفئران في المجموعة الضابطة التركيب النسيجي الطبيعي للكبد.
2. المجموعة الثانية:(المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى): أظهر الفحص المجهرى لكبد الفئران في المجموعة المريضه بالتدهن الكبدى اللاكحولى وجود اشتمالات دهنية كثيفة قد تشمل كل خلايا الكبد، حيث اظهر الفحص وجود فجوات بيضاء فى سيتوبلازم تلك الخلايا والتى أدت الى اعطاء الخليه شكل فص الخاتم مع وجود بعض الخلايا الكبدية المتكرزه.
3. المجموعة الثالثة: (المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى والمعالجة بمادة البروانثوسياندين): أظهر الفحص المجهرى لكبد الفئران في هذه المجموعة الى وجود احتقان بسيط في الأوردة المركزية مع وجود بعض الخلايا الالتهابية من النوع الليمفاوى فى المنطقة البابية.
4. المجموعة الرابعة:(المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى والمعالجة بمادة البروانثوسياندين + عقار كلوبيدوجريل): أظهر الفحص المجهرى لكبد الفئران في هذه المجموعة الى وجود اشتمالات دهنية صغيرة وقليلة العدد فى سيتوبلازم خلايا الكبد مما يوضح وجود تحسن واضح فى المعالجه بهذه المواد.
5. المجموعة الخامسة:(المجموعة المحدث بها مرض التدهن الكبدى اللاكحولى والمعالجة بمادة البروانثوسياندين + عقار ديفيروكسامين): أظهر الفحص المجهرى لكبد الفئران في هذه المجموعة وجود القليل من الاشتمالات الدهنية حيث أن بعض المناطق اظهرت النسيجي الطبيعي لخلايا الكبد.
الخلاصــة
من النتائج التي تم الحصول عليها يمكن الاستنتاج أن النظام الغذائي الغني بالدهون تسبب في مرض الكبد الدهني غير الكحولي NAFLD)) في الجرذان يعطل وظائف الكبد ويعزز الإجهاد التأكسدي، عن طريق توليد الشوارد الحرة، والذي أكده التحليل الجزيئي والكيميائي الحيوي، بالإضافة إلى التفاعلات الالتهابية، وكذلك التغيرات الحادة في التشكل المرضي للنسيج الكبد. لاسيما ان هذا الإجهاد التأكسدي المرتفع والالتهاب ارتبط بحالة النقص الكبير لميثيل الحمض النووي مع زيادة نشاط مستوى هيستون أسيتيل ترانسفيراز، بالإضافة إلى تنشيط مستويات التعبير النسبي الجينى لـكل من IL-1β و PPARα و TGF-β1 و TIMP1 و PDGFα و VEGF و MAPK في أنسجة الكبد، والتي تعكس التغيرات في مستويات نسخ هذه الجينات في مرض NAFLD. بالإضافة إلى ذلك أظهر التحليل الجزيئي للفئران المصابة بمرض NAFLD المستحث زيادة في مستويات التعبير الجينى النسبي لـ miRNA128-3p و miRNA378، مع زيادة كبيرة في إنزيمات الكبد والدهون والفيريتين في مصل الفئران المريضة.
حتى الآن، تم إجراء العديد من المحاولات للعثور على علاج جيد فعال لمرض الكبد الدهني غير الكحولي وخاصة باستخدام العوامل الطبيعية، ولكن دون نجاح. ونرجو أن تساعد هذه الدراسة في المساهمة فى ايجاد علاج ”جديد” فعال باستخدام مادة GSPE منفردة، أو كعلاج مشترك مع العقار المضاد للتخثر أو مخلب الحديد.
ومن المثير للاهتمام ، أن الدراسة الحالية أظهرت التأثير العلاجي الفعال المحتمل لتجارب العلاج الثلاثة ضد NAFLD المستحث تجريبا، والذي ينعكس من خلال حماية الكبد وتخفيف الإجهاد التأكسدي، بالإضافة إلى الخصائص المتعددة لمادة GSPE كمضاد للالتهاب و خفض شحميات الدم وكسح الشوارد الحرة، وايضا كمضاد للتليف، بالإضافة إلى خصائص التحوير فوق الجيني، أو علاجه الثنائي مع العقار المضاد للتخثر أو مخلب الحديد، الذي تم توضيحه عن طريق تحسين مستوى ميثيل الحمض النووي مع تقليل نشاط HATs في الأنسجة الكبدية المصابة ب NAFLD المستحث، وكذلك تناقص دلالات الالتهاب. علاوة على ذلك، كما يعكس هذا العلاج الزيادة المفرطة فى مستوى التعبير الجينى النسبى لكلا من miRNA128-3p وmiRNA378، استجابةً لزيادة الإجهاد التأكسدي والتفاعلات الالتهابية المصاحبة وتكوين الدهون، كما يؤدى هذا العلاج الى تحسين انزيمات الكبد، ونسبة الدهون وتركيز الفيريتين في دماء الفئران المعالجة. بالإضافة إلى التحسن الواضح في الصورة المرضية للأنسجة، مما يعكس ”اجماليا” الدور الفعال المستهدف لتجارب العلاج المشترك، خاصة باستعادة التركيب النسيجي شبه الطبيعي للكبد في الفئران المعالجة بـ GSPE وعقار مخلب الحديد.
وبالتالي، نوصي بالتأكيد بأن استخدام العوامل الطبيعية ”بما في ذلك مادة GSPE او بالاشتراك مع بعض الأدوية المتاحة حاليًا” كعوامل مضادة لـ NAFLD ومنع تطورية مهم جدًا لحماية الكبد وعلاجه من الإجهاد التأكسدي والتفاعلات الالتهابية المرتبطة بإنتاج الشوارد الحرة، لتحقيق تأثير أكبر وأشمل في أبحاث الصناعة الدوائية لتطوير أو إنتاج أدوية جديدة للوقاية أو علاج أمراض الكبد المختلفة، وخاصة NAFLD. علاوة على ذلك، فإن النتائج تعزز إمكانية استخدام مضادات الأكسدة الطبيعية (GSPE) كأحد مكونات النظام الغذائي المنتظم للمرضى الذين يعانون من السمنة المفرطة وبخاصة الذين يعانون من مرض NAFLD. أخيرًا هناك حاجة لمزيد من البحث حول الآليات الجزيئية للتسبب في مرض الكبد الدهني غير الكحولي.