الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 198 |  |  |
| | | from | 198 | | |
Abstract
مقدمة:
اثبتت العديد من الدراسات العلمية ان التوت الابيض يفيد في علاج امراض الكبد والسكري والضعف الجنسي حيث اثبتت الابحاث ان للتوت تأثيراً هرمونياً ذكرياً. وقد وجدت الدراسات العلمية في جامعة ولاية اوهايو انخفاض كبير في اورام القولون والمرئ في الفئران بعد اطعامهم التوت الاسود. وقال عالم الصيدله في الأندلس ابن البيطارعن التوت الابيض انه”حابس للاورام وقابض لها”.
تم فصل فطر الرشاشية الارضية (Aspergillus terreus) التكافلي في كل من البيئات البحرية والبرية ويشتهر بإنتاج البيوتينوليد. ينتج Aspergillus terreus بيوتيرولاكتون) 1) كمستقلب ثانوي. يتم إنتاج البيوتيرولاكتونات جينيًا عن طريق نزع الأمين التأكسدي للأحماض الأمينية مثل التيروزين والفينيل ألانين. تم عزل نثرات المستقلبات الثانوية الأخرى بما في ذلك Meroterpenoids و sesquiterpenes و sesterterpenoids و polyketides و alkaloids من سلالات أرضية أو بحرية من A. terreus على مدى العقود العديدة الماضية. ومن المثير للاهتمام ، أن البوتينوليدات ، المستقلبات المميزة في هذه الفطريات ، تمتلك العديد من الخصائص البيولوجية مثل مضادات السرطان ، ومثبطات ألفا جلوكوزيداز ، ومضادات الأكسدة ، ومضادات الملاريا ، ومضادات الأمراض النباتية. بالإضافة إلى ذلك ، يعتبر A. terreus نوعًا شائعًا من الفطريات المستخدمة في الصناعات الكيميائية والصيدلانية لإنتاج حمض إيتاكونيك وفاستاتين ستاتين منخفض الكولسترول.
قد تم اختيارفي هذا البحث جذور التوت الابيض التابع لعائلة موراسيا لفصل الفطريات المتنابتة لها وقد أظهرت النتائج
ان واحد من هذه الفطريات المفصولة غني بالمركبات و قد تم اختيار فطر (الرشاشية الارضية) الغني بالمركبات للدراسات الفيتوكيميائي البيولوجية و تم استخلاص منه سبعة مركبات من مركبات الأيض الثانوية النشطة بيولوجيا.
تشمل الرسالة عدد فصول (3)، عدد الرسومات/الصور (75)، عدد الجداول (27)، وعدد المراجع (246).
المنهجية و مواد الدراسة:
تنقسم هذه الدراسة الي ثلاثة اجزاء:
الجزء الاول
دراسة فيتوكيميائية
أ. دراسة فيتوكيميائية للتقييم الكيميائي لفطر (الرشاشية الارضية) التكافلي المفصول من جذور التوت الابيض :
1. تجميع جذور التوت الابيض وتجفيفها بالطريقة المناسبة.
2. فصل و تنقية و استنبات الفطريات المتنابتة و قد أظهرت النتائج ان واحد من هذه الفطريات المفصولة المنتمي لجنس الرشاشيات غني بالمركبات و قد تم اختياره للدراسات الفيتوكيميائية و البيولوجية
3. التعرف على الفطر المتنابت المختار عن طريق الحمض النووي استخلاص فطر (الرشاشية الارضية) التكافلي بجذور التوت الابيض.
4. التحليل الفيتوكيميائي على جزء أسيتات الايثيل لمستخلص الفطر المتنابت المختار باستخدام طرق الكروماتوجرافيا المختلفة ومطيافية الكتلة بغرض التعرف علي المركبات الطبيعية ذات فاعلية حيوية المكونة للخلاصة .
5. تجزئة الخلاصة وتحليلها باستخدام طرق الكروماتوجرافيا المختلفة مثل جهاز كروماتوجرافي سائل ذو ضغط مرتفع و متصل بمطياف الكتلة بغرض فصل المركبات الهامة من جذور النبات والتعرف عليها وكذلك من الفطريات المصاحبة و قد ادت هذه الدراسة الى فصل و التعرف علي سبعة مركبات (5 بيوتيرولاكتون و 2 مشتقات حمض أورسيلينيك) من مستخلص الفطر المتنابت من ضمنهم .
الجزء الثاني
دراسات بيولوجية
ب. دراسات بيولوجية للتقييم الحيوي لمستخلص الفطر المستنيت المفصول من جذورالتوت الابيض وتقيم حيوي للمركبات المفصولة من الفطر المستنبت ، في هذا السياق ، تم تقييم الأنشطة البيولوجية لمنتجات فطر الرشاشية الارضية MKH-B-F2 ضد بعض الكائنات الدقيقة المسببة للأمراض والحشرات الضارة بهدف:
1. تقييم النشاط المضاد للسل لمستخلص الفطر المتنابت (A. terreus EtOAc) والمركبات المعزولة.
تم إجراء اختبار مضاد السل في المختبر لمستخلص) (A. terreus والكسور والمركبات المعزولة بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). أظهرت النتائج أن المستخلص الكلي والجزء K.3 أظهروا نشاطًا واعدًا جدًا لمكافحة مرض السل. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر المركبان )2( و )6( نشاطًا قويًا لمكافحة السل بقيم MIC90 تبلغ 1.03 ± 2.1 و 2.8 ± 1.8 ميكروغرام / مل بالإضافة إلى قيم MIC البالغة 1.95 و 3.9 ميكروغرام / مل على التوالي. يمكن أن يفسر هذا النشاط الملحوظ المستوى الكبير من النشاط المعروض بواسطة الكسر K.3. إلى جانب ذلك ، أظهرت المركبات 1 و 4 و 7 نشاطًا مضادًا للتدرن مع قيم MIC90 من 9.1 ± 0.96 و 5.7 ± 0.58 و 5.6 ± 1.1 ميكروغرام / مل على التوالي وقيم MIC 7.81 و 15.63 و 7.81 ميكروغرام / مل على التوالي . وفي الوقت نفسه ، قدم المركب 5 نشاطًا معتدلًا بقيم MIC90 و MIC تساوي 21.9 ± 0.96 و 31.25 ميكروغرام / مل على التوالي. من ناحية أخرى ، أظهر المركب 3 والجزء K.8 نشاطًا ضعيفًا لمكافحة السل بقيم MIC90 تبلغ 49.3 ± 1.2 و 121.7 ± 1.4 وقيم MIC تبلغ 62.5 و> 125 ميكروغرام / مل ، على التوالي .
2. تقييم النشاط المضاد لبكتريا MRSA لمستخلص الفطر المتنابت (A. terreus EtOAc) والمركبات المعزولة.
تم إجراء تقييم في المختبر للنشاط المضاد لبكتريا MRSA للمستخلص والمركبات المعزولة التي تم الحصول عليها من (A. terreus MKH-B-F2) باستخدام تقنية انتشار الأجار. أظهر مستخلص EtOAc نشاطًا ممتازًا مضادًا لجرثومة MRSA كما تم تصويره من خلال منطقة تثبيط (inhibition zone) قطرها 16 مم مقارنةً بالتحكم الإيجابي Gentamicin الذي أنتج منطقة تثبيط (inhibition zone) بقطر 15 مم. ومن المثير للاهتمام أن المركبين 1 و 5 أظهروا نشاطًا رائعًا مضادًا لجرثومة MRSA متفوقًا على نشاط الجنتامايسين ، كما يتضح من قطر منطقة التثبيط 25 و 20 مم ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر المركبان (6) و (7) نشاطًا مثيرًا للاهتمام بأقطار منطقة التثبيط 12 و 15 ملم على التوالي. في حين أظهرت المركبات (2) و (3) و (4) نشاطا معتدلا مع أقطار منطقة التثبيط 8 و 10 و 8 ملم على التوالي.
3. تقييم النشاط المضاد للفطريات لمستخلص الفطر المتنابت (A. terreus EtOAc) والمركبات المعزولة.
أظهرت المركبات والاجزاء المعزولة من المستخلص الفطر المتنابت المختبرة أنشطة مضادة للفطريات ضد السلالات الفطرية المستخدمة بدرجات مختلفة من الحساسية. لقد أظهر المركب (5) فعالية مضادة للفطريات تفوق فعالية الكيتوكونازول الضابط الإيجابي ضد جميع الكائنات الحية الدقيقة المختبرة باستثناء S. racemosum)) الذي كان غير حساس لجميع المركبات المختبرة ، وهو المركب الوحيد الذي أظهر فاعلية ضد (C. albicans). من الجدير بالذكر أن المركبين (1) و (5) أظهروا أعلى نشاط مضاد للفطريات بين المركبات الأخرى المختبرة ضد مسببات الأمراض المختبرة. يتماشى هذا جزئيًا مع النشاط المثير للاهتمام لمكافحة MRSA للمركبات (1) و (5). أظهر المركب (1) نشاطًا قويًا وواعدًا جدًا ضد (C. neoformans) ونشاط معتدل ضد (A. fumigatus). ومن المثير للاهتمام أن المركبات الأخرى (2) و (3) و (4) و (6) و (7) ، من ناحية أخرى ، أظهرت نشاطًا انتقائيًا قويًا ومتوسطًا ضد سلالة فطرية معينة ، (C. neoformans) وكانت غير نشطة ضد السلالات الفطرية الأخرى.
4. تقييم فعالية المبيدات الحشرية لمستخلص الفطر التكافلي A. terreus MKH-B-F2) EtOAc).
أظهر مستخلص أسيتات الإيثيل (EtOAc) للفطر (A. terreus MKH-B-F2) معدل وفيات ملحوظًا بطريقة تعتمد على الوقت والتركيز. تم تقييم نشاط مبيد اليرقات للمركبات المعزولة فقط في السيليكو نظرًا لكمياتها المتواضعة او القليلة وذلك بعد أن أظهر مستخلص أسيتات الإيثيل نشاطًا واعدًا. تم تحديد علاقة ارتباط مباشرة بين تركيز المستخلص الخام ونسبة الميتو يرقات (C. pipiens). حتى مع إطالة وقت التعرض ، تظهر علاقة خطية محتملة بين التركيزات ونسب الوفيات. مع انخفاض التركيز من (300 إلى 10( جزء في المليون (ppm)، انخفض معدل الوفيات من )20 إلى 8٪(. بالإضافة إلى ذلك ، أظهر المستخلص نشاطًا مبيدًا للحشرات بطريقة تعتمد على الوقت. مع زيادة وقت الحضانة من 24 ساعة إلى 96 ساعة ، ارتفعت نسبة الوفيات من 20٪ إلى 80٪ للمستخلص بتركيز )300 جزء في المليون) وانخفض LC50 (من 65489.97 إلى 66.14( جزء في المليون(ppm) .
الجزء الثالث
الالتحام الجزيئي
ج .الالتحام الجزيئي بين المركبات المفصولة و انزيمات بكتريا السل TB)) و بكتريا المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) و فطريات كانديدا ألبيكانز (المبيضات البيضاء)(Candida albicans) و الباعِضة النابِصة( Culex pipens ) :
أجريت أربع دراسات اللتحام و الترابط الجزيئي ، بتقنيات السيليكو ، لسبعة مركبات معزولة من الفطر المتنابتA. terreus على أربعة إنزيمات مستهدفة مفترضة . هذا النهج ليس فقط لمزيد من التحقيق في التطبيقات البيولوجية المحتملة لتلك الدراسات ؛ مضادات السل ، ومضادات MRSA ، ومضادات الفطريات (Candida albicans) ، وأنشطة مبيدات الحشرات ، لكنها تكشف أيضًا عن الأنواع المختلفة من تفاعلات الارتباط وتجد أفضل وضع مناسب بين الروابط والمواقع النشطة للأهداف المعينة.
لتنفيذ الالتحام الجزيئي ، اعتمدنا برنامج (C-Docker) الذي يعتمد على مجال القوة القائم على(CHARMm) لتقييم الالتحام ، تم حساب طاقة التفاعل (-C-DOCKER) بناءً على طاقة تفاعل المستقبلات. علاوة على ذلك ، يمثل تفاعل (-C-DOCKER) طاقة التفاعل غير المرتبط بين البروتين والرابط. من المهم الإشارة إلى أن قيمة طاقة تفاعل (-C-DOCKER) الأعلى تشير إلى نتيجة أفضل وربط مفضل للبروتين-الربيطة(ligand) ، من ناحية أخرى ، تشير طاقة تفاعل منخفضة جدًا أو قيمة موجبة إلى نتيجة وتفاعل ضعيفين. النتائج مستمدة بشكل أساسي من أربع دراسات مختلفة للاتحام الجزيئي.
وفقًا لمقاربات (in silico) لهذه الدراسات الأربع ، كنتيجة للقيم الواعدة لـ (طاقة تفاعل -C-DOCKER) لجميع المركبات المختبرة في إنزيم اليرقات (carboxylesterase) ، على وجه الخصوص لقد أظهرت المركبات ، (5) ، (4) ، (1) ، (3) ، و (2) نتائج واعدة للغاية حتى أكثر من المركبات المرجعية من خلال التفاعل مع العديد من بقايا النقاط الساخنة من خلال تفاعلات مستعبدة محبة للماء وكارهة للماء. تتطلب هذه المركبات التي تحدث بشكل طبيعي مزيدًا من التحقيقات في المختبر لقدرتها المحتملة على بناء عوامل مبيدات يرقات البعوض الصديقة للبيئة.
أظهرت جميع المركبات التي تم فحصها في (2NV6) الالتحام الفعال للغاية مع الإنزيم المستهدف ، مع (طاقة تفاعل -C-DOCKER) تعادل تقريبًا أو أعلى من المركب المرجعي (أيزونيازيد). أظهرت مشتقات بوتيرولاكتون (1-5) ارتباطًا عاليًا مع 2NV6 والذي يمكن إرجاعه إلى إنزيم الأسيتيلاز المعروف في (بكتريا السل) حيث لوحظت غالبية تفاعلاته مع جزء الكربونيل لمجموعات ميثوكسي كاربونيل (ميثيل إستر) الخاصة بهم.
غير انه لسوء الحظ ، تم الحصول على نتائج ليست واعدة بالقدر الملائم من دراسة 4YDE (مضاد للفطريات) حيث أظهرت المركبات المختبرة طاقات ارتباط متوسطة إلى منخفضة تقريبًا ، والتي تم تأكيدها من خلال نشاطها المضاد للفطريات في المختبر (Candida albicans) باستثناء المركب (5) ، الذي تم عرضه في النشاط المختبري وأظهر طاقة ارتباط معتدلة تقريبًا. كما أظهرت نتائج لالتحام الجزيئي أن الارتباط يتأثر بشدة برابطة فان دير فال ، والكهرباء الساكنة ، والترابط الهيدروجيني .
الاستنتاجات و التوصيات :
في هذه الدراسة قد تم الجمع بين استراتيجيتان مختلفتان و هم اجراء بحوث بيولوجية في المختبر لمستخلص الفطر المتنابت و المركبات وايضا الالتحام الجزيئي الذي يعتبر إحدى الطرق الأكثر استخداما في تصميم الداوء المبني على البنية.
أظهرت المركبات المعزولة (5 بيوتيرولاكتون و 2 مشتقات حمض أورسيلينيك) نشاطًا مضادًا للسل قويًا ومتوسطًا مع قيم MIC تتراوح من 1.95 إلى 62.5 ميكروغرام / مل (مقارنة بإيزونيازيد ، 0.24 ميكروغرام / مل) وإمكانات واعدة لمكافحة MRSA مع أقطار منطقة التثبيط (inhibition zone diameter) من 8 إلى 25 ملم (مقارنة بالجنتاميسين ، 15 ملم). علاوة على ذلك ، أظهرت دراسة السيليكو أن المركبات المعزولة ترتبط بالمواقع النشطة للبروتينين المتوافقين مع تفاعلات (طاقات تفاعل (-C-DOCKER عالية إلى متوسطة و ايضا تفاعلات مستقرة. كما أظهرت المركبات المعزولة نشاطًا مضادًا للفطريات ضد السلالات الفطرية المختلفة بدرجات متفاوتة ، وقد أظهرت جميع المركبات المعزولة والكسور والمستخلصات الخام نشاطًا قويًا للغاية ومعتدلًا مضادًا للمكورات الخفية ( anti-Cryptococcus neoformans) ، مع استحضار المركب (5) أفضل نشاط مضاد للفطريات. وفي الوقت نفسه ، أظهر المركب (1) نشاطًا واعدًا وقويًا للغاية ضد C. neoformans) ) ونشاط معتدل ضد .(A. fumigatus) ومن المثير للاهتمام ، أن المركبات الأخرى (2) و (3) و (4) و (6) و (7) ، من ناحية أخرى ، أظهرت نشاطًا مضادًا انتقائيًا قويًا إلى معتدل ضد سلالة فطرية معينة ، و هي
(C. neoformans) و لكن كانت غير نشطة ضد السلالات الفطرية الأخرى.
نظرًا لنتائج الالتحام الجزيئي الواعدة للمركبات الطبيعية (5) و (4) و (1) و (3) و (2) في إنزيم اليرقات الكربوكسيل إستيراز(larval enzyme carboxylesterase) ، يمكن أن يصبح هؤلاء المرشحون عوامل محتملة ليرقات البعوض.