الفهرس 
IntroductionOnly 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 195 |  |  |
| | | from | 195 | | |
Abstract
في هذه الدراسة، تم جمع خمسة وخمسين عينة تربة من محافظات مصرية مختلفة، وتم استخراج مئة وسبعة وسبعين عزلة محتملة لتحليل الليجنين باستخدام وسط ملحي قليل مزود بـالليجنين كمصدر وحيد للكربون.
كما ذكر في الأبحاث السابقة، يعد إزالة اللون من صبغ النسيج أحد أهم استخدامات إنزيمات تحليل الليجنين. ولذلك، يمكن تقييم إمكانية تحلل الليجنين في العزلات عن طريق اختبار قدرتها على إزالة اللون من الأصباغ المختلفة. تم استخدام ثلاثة أنواع مختلفة من الأصباغ في هذه الدراسة وهى الازور بى(Azure B) ، الميثيلين الأزرق (Methylene Blue) ، والكونغو الأحمر (Congo Red).
تم تقييم العزلات في فحوصات المرحلة الصلبة والسائلة لقدرتها على إزالة اللون وكشفت مقايسة إزالة اللون من الصبغة في الطور الصلب أن 46 (25.9%)، 60 (33.8%)، و51 (28.8%) من العزلات البكتيرية أظهرت إزالة اللون مع الازور بى، الميثيلين الأزرق، والكونغو الأحمر على التوالي. أظهرت بعض العزلات الموجودة على اطباق الازور بى، الميثيلين الأزرق امتصاصًا للصبغة، بينما لم يحدث ذلك في البعض الآخر. ومع ذلك، فإن جميع العزلات التي تم اختبارها في اختبار الكونغو الأحمر قد امتصت الصبغة على سطح نمو العزلات. من بين إجمالي العزلات التي تم اختبارها، أظهرت 16 منها إزالة اللون مع الثلاثة أنواع مختلفة من الأصباغ المستخدمة، مما يشير إلى أنها تنتج إنزيمات مؤكسدة مثل البيروكسيداز واللاكسيس التي لديها القدرة على العمل بشكل تآزري لتكسير الليجنين. تم اختيار هذه العزلات لاحقًا لاختبار الطور السائل لمواصلة استكشاف العزلات ذات النشاط الأعلى. أظهر اختبار السائل لإزالة لون الازور بى أن العزلات المشفرة 434 و304 لديها أعلى قدرة على إزالة اللون بنسب مئوية 98.5% و72.5% على التوالي،و بنسبتى و86.3% و81% على التوالي في اختبار إزالة اللون من الميثلين الأزرق بعد يومين من الحضانة مع الصبغة دون امتصاص الأصباغ على سطح الخلايا. ومع ذلك في اختبار الكونغو الاحمر، أظهرت العزلة المشفرة 391 أعلى نشاط لإزالة اللون بنسبة 29.2%.
على غرار النتائج التي تم الحصول عليها في مقايسة إزالة اللون من صبغ الطور الصلب، أظهرت جميع العزلات التي تم اختبارها في مقايسة الطور السائل للكونغو الأحمر امتصاص للصبغة على سطح الخلايا. وبالتالي، ليس من الواضح إلى أي مدى يمكن للعزلات أن تحلل صبغة الكونغو الأحمر بدلاً من أن يتم امتصاصها.
تم التعرف على العزلات ذات القدرة الأعلى على إزالة اللون (434 و304) باستخدام تحليل التتابع النيوكليتيدي لجين الحامض النووي الريبوزومى (ٍS16) لتنتميان للنوع ستربتوميسيس إنترميديوس وستربتوميسيس جريسوروبين على التوالي. أظهر التحليل الوراثي أيضا العلاقة بين هاتين العزلتين والبكتيريا الأخرى المحللة للليجنين. تم اختيار عزلة ستربتوميسيس إنترميديوس لاستكمال الدراسة الحالية.
تم إجراء العديد من التجارب لتقدير نشاط إزالة اللون خارج الخلية وداخل الخلايا لعزلة ستربتوميسيس إنترميديوس وأظهر هذا أن نشاطها يمكن اعتباره خارج الخلية وداخل الخلية في حالة وجود الليجنين في الوسط أو بعبارة أخرى، قد يحفز الليجنين الإنتاج من الانزيمات داخل الخلايا. أشارت نتائج اختبار إزالة اللون من الصبغة في الطور السائل واختبارات المادة الطافية / المحللة الخلوية لعزلة ستربتوميسيس إنترميديوس إلى أن إضافة الصبغة تحت ظروف نمو العزلة الاختبارية يمكن أن تحفز زيادة إنتاج الانزيمات المحللة للليجنين وبالتالي زيادة نشاط إزالة اللون من الصبغة.
تم أيضًا تحديد نشاط إزالة اللون في ظل ظروف النمو في الوسط الذى يحتوى على الليجنين والخالى من الليجنين وبعد حضانة النمو البكتيري لعزلة ستربتوميسيس إنترميديوس مع صبغة الازور بى، كانت قدرة إزالة اللون في الوسط الخالى من الليجنين (LB)هي 0.002% و0.06% و30% بينما في الوسط الذى يحتوى على الليجنين كانت 6.8% و21% و41% بعد إضافة الصبغة عند 0 و4 و24 ساعة على التوالي، مما يشير إلى أن الوسط المحتوي على الليجنين يمكن أن يحفز الكائنات الحية الدقيقة على إنتاج إنزيمات محللة اللجنين خلال فترة زمنية أقصر.
تم إجراء تجارب التحسين لزيادة إنتاج الانزيمات المحللة لليجنين وتقليل الوقت اللازم لإزالة اللون من الصبغة بواسطة عزلة ال ستربتوميسيس إنترميديوس باستخدام طريقة العامل الواحد في كل مرة (OFAT) متبوعة بمنهجية سطح الاستجابة (RSM) . تضمن طريقة العامل الواحد في كل مرة تحسين العديد من العوامل التي تؤثر على إنتاج الإنزيمات (حجم اللقاح، فترة الحضانة، سرعة التحريك، درجة حرارة الحضانة، مصادر الكربون
المختلفة، تركيز الليجنين، مصادر النيتروجين المختلفة، ودرجة الحموضة الأولية لوسط التخمير) وتحديد نطاقاتها المثلى. تم إجراء جميع التجارب باستخدام صبغة الازوربى لأنها الصبغة الأكثر مقاومة وتحتاج إلى عمل تآزري من البيروكسيداز واللاكسيس لإزالة اللون. باستخدام منهجية سطح الاستجابة، تم تحسين تركيز الليجنين وتركيز التربتون ودرجة الحموضة الأولية للوسط وفترة الحضانة باستخدام حزمة البرامج الإحصائية. أظهر النموذج أن الظروف المثلى لإنتاج الانزيمات المحللة لليجنين وبالتالي أعلى نسبة إزالة الصبغة هي الرقم الهيدروجيني 9.8، وكمية الليجنين 583 ملغم/لتر، وكمية التريبتون 5.4 جم/لتر، ووقت الحضانة 40.6 ساعة. أدت تجارب التحسين الشاملة إلى زيادة قدرها 2.6 أضعاف في نسبة إزالة اللون من الصبغة (59.75%) والتي تم تحقيقها بعد 4 ساعات من الحضانة مع نمو بكتيريا ستربتوميسيس إنترميديوس مقارنة بتلك التي تم الحصول عليها في ظل الظروف الاصلية (22.69 %).
علاوة على ذلك، تم إجراء عملية تسلسل الجينوم بالكامل على عزلة ستربتوميسيس إنترميديوس للكشف عن الجينات ذات الصلة المتعلقة بتحليل الليجنين وأنشطة إزالة اللون من الصبغة. بعد فحص التسلسل الجينومي، تم اكتشاف العديد من الجينات المشفرة للأنزيمات المتعلقة بإزالة بلمرة الليجنين مثل البيروكسيديز واللاكسيس، والرديوكتيز ،والأوكسيدوريداكتيز، والأوكسيديز. بالإضافة إلى ذلك، تم أيضًا تحديد الجينات المشفرة للأنزيمات المرتبطة بتحليل المواد المشتقة من الليجنين بما في ذلك إنزيمات الدي اوكسيجينيز، وأحادية الأوكسجينز، والهيدراتاز، والترانسفيراز. والجدير بالذكر أن أنشطة إزالة اللون من الصبغة التي شوهدت في هذا البحث تم تأكيدها بواسطة وجود جينات مشفرة لأنزيمات البيروكسيديز واللاكسيس والازوريداكتيز الموجودة في التسلسل الجينومي لعزلة ستربتوميسيس إنترميديوس.
تمت مقارنة تسلسلات الأحماض الأمينية للجينات التي تشفر الإنزيمات المحللة للليجنين مع تسلسلات الأحماض الأمينية الأخرى التي تم إيداعها في قاعدة بيانات NCBI باستخدام خوارزمية BLASTP لاكتشاف التشابه بينها. وباستخدام هذا النهج، تمكنا من تحديد الجينات المتوقعة المسؤولة عن جميع المسارات المؤدية إلى تحليل الليجنين.
أخيرًا، قدم هذا المزيد من الأدلة على قدرة هذه السلالة في التطبيق المحتمل لتحليل الليجنين والمعالجة الحيوية لنفايات صبغ النسيج.
المستخلص العربي
الليجنين هو أحد أكثر البوليمرات انتشارًا على وجه الأرض. أثناء عملية فصل الألياف في صناعة الورق، يتم التخلص من كرافت الليجنين بكميات كبيرة وقد يتسبب في تلوث خطير في النظم البيئية المائية. أفادت العديد من التحقيقات أن العديد من الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن تحلل الليجنين. جذبت الإنزيمات المحللة للليجنين الاهتمام مؤخرًا بسبب تطبيقاتها المختلفة في العمليات الصناعية. حيث يمكنهم تحطيم الليجنين بشكل انتقائي وتحويله إلى منتجات ذات قيمة مضافة. علاوة على ذلك، وجدوا أن الإنزيمات المحللة للليجنين لديها القدرة على إزالة ألوان عدة أنواع من الأصباغ مما يجعلها كنزًا في الصناعة ولها أهمية كبيرة نظرًا لتطبيقها الرائع في إزالة لون مياه الصرف الناتج عن عملية صبغ المنسوجات وأيضا في المعالجة الحيوية لعمليات صناعية أخرى.
في هذه الدراسة، تم فصل 177 عزلة بكتيرية من عينات التربة الزراعية التي تم جمعها من مواقع مختلفة في مصر. بعد التنقية، تم تقييم العزلات في فحوصات المرحلة الصلبة والسائلة لقدرتها على إزالة اللون من عدة أنواع من الأصباغ مثل الازور بى(Azure B) ، الميثيلين الأزرق (Methylene Blue) ، والكونغو الأحمر (Congo Red). وبناءا على نتائج الدراسة تم اختيار العزلتان 434 و304 اللتان لهما قدرة على إزالة اللون الأعلى للصبغات وتعريفهما باستخدام تحليل التتابع النيوكليتيدي لجين الحامض النووي الريبوزومى (ٍS16) حيث وجد انهما تنتميان للنوع ستربتوميسيس إنترميديوس وستربتوميسيس جريسوروبين على التوالي. أظهر التحليل الوراثي أيضا العلاقة بين هاتين العزلتين والبكتيريا الأخرى المحللة للليجنين.
تم اختيار عزلة ستربتوميسيس إنترميديوس لتجارب التحسين التي أجريت باستخدام طريقة عامل واحد في كل مرة (OFAT) لتحديد العناصر التي تؤثر على إنتاج الانزيمات المحللة للليجنين. تم إجراء مزيد من تجارب التحسين باستخدام منهجية سطح الاستجابة (RSM). أدت تجارب التحسين إلى زيادة بمقدار 2.6 ضعفًا في قدرة إزالة لون صبغة الازور بى بعد 4 ساعات من الحضانة مع نمو البكتيريا مقارنة بالظروف الاصلية. وبذلك تم زيادة إنتاج الإنزيمات المحللة للليجنين وتم تقليل الوقت اللازم لإزالة لون صبغة الازور بى. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء عملية تسلسل الجينوم بالكامل (WGS) على عزلة ستربتوميسيس إنترميديوس للكشف عن الجينات ذات الصلة المتعلقة بتحليل الليجنين
وأنشطة إزالة الصبغات. بعد تحليل التسلسل الجيني، تم تحديد العديد من الجينات المشفرة للأنزيمات المتعلقة بتحليل الليجنين وأنشطة إزالة الصبغات. تمت مقارنة تسلسلات الأحماض الأمينية للجينات التي قامت بتشفير المنتجات المحللة للليجنين بتسلسلات الأحماض الأمينية الأخرى التي تم إيداعها في قاعدة بيانات NCBI لاكتشاف التشابه بينهما. باستخدام هذا النهج، تم تحديد الجينات المتوقعة المسؤولة عن المسارات المؤدية إلى تحليل الليجنين. وفقًا لذلك، قدمت هذه الدراسة مزيدًا من الأدلة على قدرة هذه السلالة في التطبيق المحتمل في تحلل الليجنين والمعالجة الحيوية لتدفق صبغة النسيج.