الفهرس 
Abstract…Only 14 pages are availabe for public view
 |  | from | 259 |  |  |
| | | from | 259 | | |
Abstract
الملخص العربي
ل-أسباراجناز هو إنزيم مهم يستخدم في أنظمة العلاج الكيميائي المركب لعلاج سرطان الدم الليمفاوي الحاد (ALL) ومنذ دمجه في بروتوكولات علاج الأطفال، فقد ساعد في تحقيق معدل شفاء مرتفع. نظرًا لفعاليته العلاجية، يعتبر ل-أسباراجناز علامة فارقة في علاج السرطان، ومع ذلك، فقد ارتبط استخدامه بمعدل مرتفع من فرط الحساسية وتفاعلات السمية. هناك حاجة حالية لاكتشاف إنزيم ل-أسباراجناز جديد ذو خصائص محسنة وآثار ضارة أقل مقارنة بتلك المتوفرة في السوق.
لـ ل-أسباراجناز تطبيق آخر في صناعة المواد الغذائية. تتمثل في إضافة إنزيم ل-أسباراجناز قبل المعالجة الحرارية و ذلك لمنع الإفراط في تخليق مادة الأكريلاميد في الأطعمة التي تحتوي على البطاطس والحبوب. وقد تم استخدامه بشكل فعال في تحضير الحبوب وتصنيع البطاطس المقلية ورقائق البطاطس، مما أدى إلى تقليل مادة الأكريلاميد بفعالية تصل إلى 62%. أدى اضافة ل-اسباراجناز الى الخبز والبسكويت وخبز الزنجبيل وصناعة المعجنات المقلية الي انخفاض بنسبة تزيد عن 90% في مادة الأكريلاميد.
قد تم اكتشاف عزلة الإستينوتروفوموناس مالتوفيليا كمصدر جديد وواعد لـ ل-اسباراجناز. وبناءً على ذلك، فإن الهدف من هذه الدراسة هو إنتاج شكلين (مؤتلف وأصلى) من ل-أسباراجناز ذات كفاءة مماثلة مع ل-أسباراجناز المتوفر تجاريًا والذي قد يكون مفيدًا في الصناعات الدوائية والعلاجية.
ولتحقيق ذلك، تم إجراء أول تكثيف التعبير جيني لعزلة الإستينوتروفوموناس مالتوفيليا باستخدام تركيزات مختلفة من الكلورامفينيكول لتعزيز إنتاجية العزلة وتم زيادة إنتاجيته عن طريق التعريض المسبق للكلورامفينيكول بتركيز 200 ميكروجرام/مل.
تم تكثيف الجين الخاص بإنزيم ل-أسباراجناز بنجاح من الإستينوتروفوموناس مالتوفيليا باستخدام البادئات المناسبة التي تم تصميمها للسماح بإدخال مواقع القطع لإنزيمات Nde1 وBamH1. بعد ذلك تم هضم الجين ل-أسباراجناز المضخم وناقل الاستنساخ pET22b مرتين باستخدام إنزيمات القطع. تم بعد ذلك ربط منتجات PCR المقطعه والبلازميد المقطع معًا باستخدام ligase T4-DNA لإنتاج البلازميد المؤتلف pET22b- ل-أسباراجناز.
تم بعد ذلك ادخال البلازميد المنتج إلى الإيشيرشيا كولاية DH5α كمضيف استنساخ. ثم تمت زراعة مضيف الإستنساخ على أطباق LB مضاف إليها بالأمبيسلين وتم استخدام تقنية مستعمرة PCR لتحديد المستعمرات المستنسخة الإيجابية. تم استخراج بلازميد pET22b- ل-أسباراجناز المؤتلف من الاستنساخ الصحيح المحدد لـ E. coli DH5α باستخدام مجموعة استخراج البلازميد. ثم تحول البلازميد المستخرج إلى الإيشيرشيا كولاية BL21 (DE3) كمضيف عالإنتاج عن البروتين المؤتلف تحت تأثير مروج T7. تم إجراء التحقق من صحة التحول الناجح لـ pET22b- ل-أسباراجناز المؤتلف إلى استنساخ الإيشيرشيا كولايةBL21 (DE3) المحدد باستخدام تقنية مستعمرة PCR.
تم تحسين إنتاجية ل-أسباراجناز المؤتلف باستخدام تقنية معامل واحد لكل وقت متبوعا بمنهجية سطح الاستجابة response surface methodology (RSM). لتحسين التعبير، كانت الخطوة الأولى هي تحسين معايير العملية المتعلقة بأربعة متغيرات؛ درجة حرارة الحضانة، وقت الحضانة بعد الحث وتركيز IPTG، ومعدل التقليب. كشفت نتائج معامل واحد لكل وقت أن تعبير ل-أسباراجناز قد تم تحفيزه عند 37 درجة مئوية، 1 ملم IPTG، 250 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
تم استخدام النطاقات المثالية التي تم الحصول عليها من اختبارات معامل واحد لكل وقت في نموذج RSM. تم إجراء التحسين باستخدام منهجية سطح الاستجابة (التصميم المركب المركزي Box – Behnken)، يتكون النموذج من 27 تجربة وقيمة R2 0.981 والحد الأقصى المتوقع للتعبير الإنزيمي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، 250 دورة في الدقيقة، وتركيز IPTG قدره 0.83 ملم بعد الحضانة لمدة 17 ساعة.
تم التحقق من صحة ظروف الحث الأمثلل لإنتاج الإنزيم باستخدام اختبار نشاط ل-أسباراجناز. تمت تنقية البروتين المؤتلف الذي تم الحصول عليه باستخدام عمود الدوران Ni-NTA. تم إجراء SDS-PAGE وأظهر شريط بروتين واحد بوزن جزيئي قدره 17 كيلو دالتون.
تمت تنقية ل-أسباراجناز الأصلي باستخدام الخطوات التالية: الترسيب بواسطة كبريتات الأمونيوم متبوعًا بكروماتوجرافيا عامود استبعاد الحجم (Sephadex G-100). تم قياس كمية البروتين باستخدام اختبار برادفورد عند 25 درجة مئوية مع إستخدام ألبومين المصل البقري كمعيار مرجعي.
تم إجراء SDS-PAGE للكشف عن الوزن الجزيئي للبروتين. أظهرت النتائج أن ل-أسباراجناز يمكن تنقيته إلى درجة التجانس عن طريق ترسيب كبريتات الأمونيوم وأظهر الشكل المنقى الذي تم الحصول عليه بواسطة تحليل كروماتوجرافيا عامود استبعاد الحجم نشاطًا إجماليًا قدره 96.4375 وحدة دولية / مل ونشاطًا محددًا قدره 36.251 وحدة دولية / ملغ من البروتين. كشف تحليل SDS-PAGE أن الشكل المنقى للإنزيم منفصل بوزن جزيئي ظاهري قدره 17 كيلو دالتون.